Windows to the Brain寻找「大脑之窗」的奇幻之旅
施福东教授在2020年全国神经病学年会大会报告回顾
（2020年9月19日；超过18000名神经科医生在线聆听了该报告。作者：郑培，陈京山博士）
2014年上映经典的科幻电影《超体》，不知大家是否还记得，影片中讲述一位教授研究开发大脑的潜力。海豚能利用脑神经元的20%，天生具有声呐系统。人类现在仅利用了大脑神经元的10%，就已经体现如此的创造力：其发明可以飞天遁地，日月并行。如果我们能够动员20%的神经元，链接无限的潜能，也许将会克服目前人类面临的危机，疾病，能源资源的过度使用造成的匮乏，全球变暖威胁人类和万物的家园……
神经科学家、神经科医生对于大脑的无限潜能充满着永久的好奇, 那么如何能够有一面窗子，观察到人脑神秘的运行，重新认识大脑生理和病理的结构与变化。只有做到这一点，我们才有可能真正地认识脑部疾病，为有效和精准治疗奠定基础，发挥出医学无限的潜力，造福患者。施福东教授9月19日在全国神经病学年会上，通过其团队近期的工作，生动地描绘了神经科医生如何利用经典和最先进的生物技术，作为研究神经疾病独特的“窗口”。「脑之窗」的奇幻之旅开启……
图1：施教授报告首页--Windows to the Brain
旅程之中的第一道强光：脑衰老与免疫
通过比较和筛选年轻和老年人群脑组织的免疫印记，发现以自然杀伤(Natural Killer)细胞为代表的免疫细胞随着年龄增长在人脑内逐渐增加。这些细胞大多位于脑内神经发生的齿状回区域，并与神经前体细胞相临近(图2)。该课题组结合单细胞测序和蛋白质组技术，进一步发现部分衰老的神经前体细胞高表达包括白介素27在内的多种衰老相关表型。通过基因编码和谱系示踪方法证实，这些免疫因子可以激活并扩增脑内聚集的免疫细胞。此外，RNA测序和免疫筛选等证据表明，衰老导致神经前体细胞表面的主要组织相容性复合体I类分子(MHC-I)下调，造成免疫耐受缺失，从而在正常脑衰老过程中激活免疫监视，损伤神经前体细胞。通过免疫干预清除衰老大脑内的免疫细胞，能够促进神经前体细胞的存活并改善认知功能。这一研究成果将于2020年11月在Nature Neuroscience发表。这项研究利用经典手段，即正常人脑组织结合新型高通量手段，揭示了免疫与脑衰老的关系。
图2：衰老大脑内的免疫细胞和神经前体细胞。在衰老大脑中的神经发生区域，由于免疫耐受性的缺失，导致神经前体细胞(如图，具有突起的紫色细胞)被以NK细胞为代表的免疫细胞(蓝色球形细胞)清除。
“不识庐山真面目，只缘身在此山中”
急性脑损伤迅速引起外周多个系统和器官的剧烈变化(刘强，金薇娜等，Immunity 2017)。这些远隔变化可以反应脑损伤的情况，因此为理解脑疾病打开了一面新的窗子。通过分析脑出血病人去骨瓣减压手术取得病人的骨髓细胞，团队发现脑出血快速激活骨髓造血干细胞。结合micro PET成像、基因编码和谱系示踪等技术，进一步发现脑出血后机体通过神经支配，导致骨髓在短时间内生成具有免疫抑制功能的单核细胞。通过Nanostring筛选和免疫印记技术，课题组还发现了介导骨髓内造血细胞生成单核细胞的分子开关。作为脑出血后的一种自身保护机制，这些新生的单核细胞迁移到脑内病灶，最终抑制神经炎症和血肿周围脑水肿。此外，使用已获FDA批准的选择性β3肾上腺素受体激动剂，可以促进骨髓生成更多具有免疫抑制功能的单核细胞，从而减轻神经炎症并改善脑出血预后。该研究通过明确脑损伤后远隔组织和细胞组分变化，揭示了在漫长的进化过程中，受损伤的脑可以调度外周的细胞去脑内救援。神经科医生可以通过放大这个自我保护的机制来减轻脑损伤(图3)。该工作将于2020年底发表于Science Translational Medicine。
图3：脑出血通过神经支配快速活化骨髓造血干细胞。脑出血后急性期，机体通过交感神经支配激活骨髓造血系统。造血干细胞和下游的髓系前体细胞快速增殖，导致骨髓在短期内生成大量具有免疫抑制作用的单核细胞。这些单核细胞随后迁移至脑损伤区域。通过神经调节或免疫干预，可以促进脑出血后骨髓内生成更多具有免疫抑制作用的单核细胞，从而压制脑出血后的神经炎症并减轻脑水肿。
天文观象与脑观象：神经影像和可视化技术的应用
普通和分子影像技术，如OCT、MRI等也可用于观察脑部的结构和功能。今年五月发表在《柳叶刀-神经病学》(The Lancet Neurology)上的TANGO试验，应用了这两项技术跟踪视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorder，NMOSD)患者眼，脑和脊髓在治疗中变化(图4)。TANGO试验是由施教授牵头、张超博士作为第一作者协调全国六家医院参与完成的大型随机对照临床试验结果。该试验报道IL-6R阻断剂托珠单抗(Tocilizumab)较传统的免疫抑制剂硫唑嘌呤(Azathioprine)，在降低NMOSD患者的复发率和致残率上具有明显优势，为该疾病的治疗提供了高级(I级)循证医学证据。TANGO试验是一个研究者自主设计、自筹经费、独立于任何制药公司、全球首个头对头对比性的随机对照研究。TANGO试验结局将极大地促进靶向IL-6R疗法进入NMOSD的国际诊疗指南，指导全球神经科医生如何选择新的靶向治疗和传统的免疫抑制剂。
图4：左：TANGO试验的主要结果发表在The Lancet Neurology (2020年5月)；右：托珠单抗较硫唑嘌呤可显著降低视神经脊髓炎谱系疾病患者的复发风险。
团队近期利用单细胞测序技术，系统评估了NMOSD患者B细胞在骨髓、血液和脑脊液中发育，分化和自身免疫抗体的生成过程，揭示了自身反应性B细胞在外周和中枢活化，以及免疫耐受缺失的分子机制。为研发NMOSD精准免疫干预的新疗法，带来了新的光明(图5)。
图5：NMOSD患者B细胞单细胞测序实验流程。取NMOSD患者的外周血、骨髓和脑脊液组织样本，通过流式细胞术分选获得高纯度的B细胞，然后在10´Genomics单细胞测序平台上对B细胞进行转录组测序，实现单次上万个细胞的快速高效标记、测序和分析，获得单个B细胞水平的基因表达谱和差异情况。通过对各个B细胞群体的划分与细胞群体间差异表达基因的检测，以及大规模分析，高效处理数万个B细胞及其不同亚群的转录反应，从而揭示记忆B细胞和自身免疫性B细胞的活化、克隆扩增和产生自身反应性抗体的分子特征。
7T超高场磁共振实现了亚毫米级的三维高分辨率成像，进而观察到3T上难以呈现的组织细节和微小病变。在超高场平台功能成像的神经活动对比度显著增强，波谱扫描的谱宽扩展促进不同成分的高分辨解析。这为窥探脑内疾病的奥秘提供了新的有力工具(图6)。
图6 左：3T-MRI与7T-MRI头颅影像对比。右：国家神经疫病临床研究中心/北京天坛医院7T MRI装机。
随着脑可视化技术进展，团队与程和平院士的南京脑观象台团队合作，利用微型双光子显微镜，首次观察到清醒状态下小鼠癫痫发作时的神经元异常放电表现，即抽搐行为发生时，神经元同步、高频、峰值紊乱的特异性电活动。这项工作利用前沿技术，有望解答癫痫发生发展的新机制(图7)。
图7 左：癫痫小鼠抽搐状态下，M1区神经元特异性电活动的代表性图像(1-9代表9个随机选择的神经元，10代表背景荧光强度)。右下：对应的神经元电活动的定量分析。荧光变化幅度(△F/F0)展现癫痫状态下神经元在规定时间窗内的电活动。
脑流体活检（fluid biopsy）：体液标记物
神经系统各种损伤和退行性变化所产生的蛋白质，DMAP等和其引起的免疫反应能反应其慢性，亚临床的微小变化，通常在目前影像学手段无法检测出来。这些信号可以在脑脊液，外周循环血中检测出来，动态反应脑部变化，同时克服重复MRI，PET，脑活检所带来的费用负担和损伤，称为脑“液体活检”，或者体液标记物。这些手段为跟踪脑疾病进展提供了不可替代的手段，因此可以作为脑流体窗口。神经丝蛋白(NfL)作为多发性硬化进展的标记物已经成为共识。NfL预测神经退行性和其他疾病的价值正在被揭示 (图8)。团队陈京山，郑培等首先检测了神经丝蛋白(NfL)在我国健康人群中的表达水平，建立了中国人NfL阴性区间参考。发现健康人群中，血浆NfL水平和年龄呈正相关，并建议NfL的阴性区间需要依据年龄划分。进一步在卒中病人中，发现NfL对卒中进展和预后的预测，显著优于其他生物标志物。对于未知的新体液标记物，施教授介绍了团队基于蛋白组学的体液标记物筛选工作。从病人血浆或外泌体中分离蛋白进行质谱蛋白组学鉴定，筛选到差异蛋白后，根据蛋白不同峰度应用ELISA或超敏检测平台进行表达验证，并结合影像学和临床数据，筛选出用于鉴别诊断、疗效及预后评估的体液标记物组合(图8)。对于体液标记物研发的下一步工作，将结合多组学与人工智能手段，开展炎性相关的神经系统疾病标志物组合筛选，以期找到用于辅助诊断、预后评估的体液标记物、药物干预靶点，并应用动物疾病模型深入探索病理机制。
图8 左：神经系统疾病导致轴突损伤后，NfL被释放到脑脊液，并通过血脑屏障进入外周血。右：脑内发生病理变化造成神经系统损伤后，细胞损伤相关分子通过外泌体释放入外周血，外泌体中含有的蛋白和RNA与疾病严重程度相关，可通过多组学技术(包括蛋白组，转录组等)予以筛选和鉴定。
近年来随着实验室检测方法和手段不断更新，国内多家单位或公司基于自身条件建立神经免疫疾病的相关检测，但不同中心使用的检测方法和体系仍有很多不同，缺乏统一的行业标准，而且目前CFDA批准的检测试剂盒非常有限。以神经免疫疾病膜表达自身抗体检测为例，目前公认的最特异的检测方法为基于细胞的间接免疫荧光检测(Cell-based assay, CBA)，该方法能够维持抗原的自身构象、蛋白修饰等优点，但目前国内尚没有CFDA认证的CBA法检测试剂盒。基于这一现状，施教授描述了团队多年来致力于神经免疫疾病实验室诊断平台建立和技术革新，并支持团队人员组建了研发转化团队-天海新域。目前，施教授转化团队已经建立成熟的神经免疫疾病检测体系和新体液标记物开发平台，包括基于细胞免疫、免疫印迹、免疫磁珠检测、单分子等超敏外周血检测平台，以及基于多组学的新体液标记物开发平台。旨在创造有独立知识产权，国际一流技术和质控从而在中国及国际推广。 (天海新域：www.newterrain.cn Lab for life)。
图9 神经免疫疾病体液诊断市场转化团队—天海新域
脑网络和医院信息网络：涓涓细流融入大海
全脑介观神经连接图谱的显微光学切片断层成像可以勾画脑空间信息学及神经连接图谱，获得病理模型下特定神经环路精细图谱，对研发脑重大疾病的早期诊断、精准干预(包括病前干预和疗后康复)的新技术、新方法是至关重要的(Li, et al. Science 2010; Gong et al. Nature Communications 2016)。骆清铭院士提出脑空间信息学(Brainsmatics)概念，旨在将脑作为一个完整的系统，顺应智能技术发展需求，以脑科学、系统科学和信息科学的基本理论为指导，运用新兴的全脑高分辨精准空间定位与成像方法，同时结合多种前沿脑科学研究技术，标记、获取、分析和可视化具有明确空间尺度和位置的精细脑网络结构与功能信息，从大数据中提取跨层次、多尺度的脑连接时空特征，揭示感知、情感和意识等脑连接空间信息机理，从而促进脑健康与智能技术的跨越式发展。
国家医院质量监测系统对全国公立医院(HQMS)的全覆盖和诊断信息的收集，类似于脑网络和脑信息汇总，分析和处理 (图10)。施教授介绍了以田德财为主的团队通过HQMS统计了中国全年龄段和31省市的多发性硬化(MS)和视神经脊髓炎谱系疾病的发病率，均在Lancet Regional Health 发表(图10)。本研究填补了近14亿中国人MS和NMOSD流行病学资料的空白，完善了全球MS和NMOSD发病率的地图，为国家医保政策的制定提供了基础。
图10 左：施教授向UCB亚太区负责人介绍国家神经系统疾病信息平台，类似脑收集和处理信息。该平台实施动态监测全国31省、自治区、直辖市神经系统疾病的诊治情况。右：利用中国传统的女性花旦形象，体现了MS和NMOSD主要累及青年女性，虽然病痛消瘦，但目光明亮，充满对疾病治愈的期望。背景提示本项工作在依托北京天坛医院的国家神经系统疾病临床医学研究中心完成。
脑之窗：神接苍穹
施教授的报告把自己作为一个神经科医生对脑的好奇和探索融入了激情，对未来通过解开脑的神秘面纱，以减少脑疾病的痛苦，激发人类的良知和潜能，克服人类面临的共同困境，充满乐观和向往。他的结束语：如果你站到顶峰，对天空和大地就会获得神奇的视野；如果你能和我们并肩利用最先进科学技术，寻找大脑之窗以战胜脑疾、挖掘人类智慧使我们努力摆脱目前面临人类和所有物种前所未有的困境，你会看到我们美丽的思想---the beautiful mind。
